Laporan
Praktikum Nama : Eka Lindawati
Mikrobiologi Kelompok : 8
NIM : J3L112138
Hari,
tanggal : Jum’at, 4 Oktober 2013
Waktu : 14.00-17.20 WIB
PJP : M. Arif Mulya, S.Pi
Asisten : Lia Suliani
Ramdhani
Yuriska Sekar Rani
KUANTITAS MIKROBA HITUNGAN
MIKROSKOPIS LANGSUNG
PROGRAM
KEAHLIAN ANALISIS KIMIA
PROGRAM
DIPLOMA
INSTITUT
PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Pendahuluan
Mikroba ialah jasad renik yang
mempunyai kemampuan sangat baik untuk bertahan hidup. Jasad tersebut dapat
hidup hampir di semua
tempat di permukaan bumi. Mikroba mampu beradaptasi dengan lingkungan yang
sangat dingin hingga lingkungan yang relatif panas, dari ligkungan yang asam
hingga basa. Berdasarkan peranannya, mikroba dapat dikelompokkan menjadi dua,
yaitu mikroba menguntungkan dan mikroba merugikan (Afriyanto 2005). Istilah
pertumbuhan umumnya dipergunakan bakteri dan mikroorganisme yang lainnya dan
biasanya lebih mengacu pada perubahan di dalam hasil panen sel dan bukanlah
dilihat dari pertambahan jumlah individu
mikroorganisme tersebut. Suatu proses pertumbuhan menyatakan pertambahan jumlah
atau massa yang melebihi dari yang ada di dalam inokulum asalnya (Volk 1993). Dengan penggunakan medium pertumbuhan, aktivitas mikroba dapat dipelajari
dan dengan medium tumbuh dapat dilakukan isolasi mikroba menjadi kultur murni,
perbanyakan, pengujian sifat fisiologis, dan perhitungan jumlah mikroba
(Pelczar 1986).
Pengukuran
kuantitatif populasi suatu mikroba dapat dilakukan dengan penetuan jumlah sel dan penentuan sel (Fardiaz 1992).Ada berbagai macam
cara untuk mengukur jumlah sel antara lain dengan hitungan cawan, hitungan
mikroskopis langsung atau dengan alat colony counter (Hadioetomo 1993). Perhitungan
langsung (direct count) untuk jumlah
sel atau biomassa mikroorganisme dan sel dihitung langsung di bawah mikroskop
atau dengan perhitungan partikel elektronik (electronic particle counter). Pengukuran langsung (direct measurement) untuk biomassa
mikroorganisme, massa sel dapat ditentukan dengan menimbang atau mengukur berat
seluruh sel, dan biomassa dapat dikorelasikan dengan jumlah sel dengan
membandingkan pada kurva standar. Perhitungan tidak langsung (indirect count) untuk jumlah sel,
mikroorganisme dalam sampel dikonsentrasikan dan ditanam pada media yang
sesuai, pertumbuhan mikroorganisme contohnya pembentukan koloni dalam pelat
agar, digunakan untuk memperkirakan jumlah mikroorganisme yang terdapat di
dalam sampel. Perkiraan tidak langsung (indirect
estimate) untuk biomassa mikroorganisme, biomassa mikroorganisme
diperkirakan dengan mengukur komponen biokimia sel mikroorganisme yang
relative konstan, seperti protein, adenosine trifosfat (ATP), lipopolisakarida
(LPS), murein dan klorofil. Biomassa juga dapat diperkirakan secara tidak
langsung dengan mengukur kekeruhan. Perkiraan tidak langsung biomassa
mikroorganisme dapat dikorelasikan dengan jumlah sel dengan membandingkan
dengan kurva standar (Harmita 2006).
Tujuan
Praktikum bertujuan untuk
menghitung jumlah sel pada sampel yeast dengan
menggunakan teknik hitungan mikroskopis langsung.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan
ialah mikroskop, pipet tetes, cover glass, Counter dan
Haemocytometer.
Bahan-bahan
yang digunakan ialah Metilen Blue (MB), alkohol 70% dan
suspensi yeast/khamir.
Prosedur
Permukaan
bidang Haemocytometer dan cover glass dibersihkan dengan tissue. Cover glass
diletakkan di atas permukaan hitung Haemocytometer. Kemudian suspensi khamir/yeast dikocok dan diambil dengan pipet
tetes sebanyak 0,1-0,5 mL. Suspensi tersebut diletakkan pada ruang hitung
haemocytometer dan diamati jumlah khasmir/yeast
dengan mikroskop dimulai dengan menemukan kotak hitung terlebih dahulu.
Data dan Hasil Pengamatan
Tabel 1 Hasil hitungan mikroskopis langsung
|
Kelompok
|
Jumlah sel mikroba
|
|
1
|
3,605 x 107
|
|
2
|
1,863 x 107
|
|
3
|
7,275 x 107
|
|
4
|
4,235 x 107
|
|
5
|
4,19 x 107
|
|
6
|
2,275 x 107
|
|
7
|
6,965 x 107
|
|
8
|
1,48 x 107
|
|
9
|
3,16 x 107
|
|
10
|
3,5 x 107
|
Gambar 1 Hasil haemocytometer pada sampel Yeast sebelum ditambahkan metilen
blue (MB) (a) dan setelah ditambahkan metilen blue (b).
Pembahasan
Kuantisasi
mikroba dengan perhitungan mikroskopis secara langsung menggunakan suspensi khamir/yeast sebagai bahan uji. Khamir/yeast termasuk ke dalam golongan fungi.
Pada umumnya, sel khamir lebih besar dari pada kebanyakan bakteri, tetapi
khamir yang paling kecil tidak sebesar
bakteri yang terbesar. Khamir sangat beragam ukurannya, berkisar antara 1-5 µm
lebarnya dan panjangnya dari 5-30 µm atau lebih. Khamir umumnya mempunyai
morfologi uniselular dan tidak dilengkapi flagelum atau organ-organ penggerak
lainnya. Khamir bersifat fakultatif yang artinya mereka dapat hidup hidup baik
dalam keadaan aerobik maupun keadaan anaerobik (Pelczar 1986).
Khamir terdapat
pada makanan seperti roti. Mikroba yang terkandung dalam makanan
bisa menyebabkan terjadinya kerusakan mikrobiologis pada makanan sehingga tidak
layak untuk dikonsumsi. Untuk mengetahui layak atau tidaknya suatu bahan
makanan untuk dikonsumsi oleh masyarakat, perlu dilakukan pengujian mikroba
yang terkandung dalam makanan tersebut, salah satu cara tersebut adalah dengan
analisis kuantitatif mikrobiologi pada bahan pangan (Buckle 1987). Penentuan
jumlah angka mikroorganisme sangat penting dilakukan untuk menetapkan keamanan
suatu sediaan farmasi dan makanan. Berbagai metode telah dikembangkan untuk
menghitung jumlah mikroorganisme. Metode tersebut menghitung jumlah sel, massa
sel, atau isi sel yang sesuai dengan jumlah sel. Terdapat empat macam cara umum
untuk memperkirakan besar populasi mikroorganisme, yaitu perhitungan langsung,
pengukuran langsung, perhitungan tidak langsung dan perkiraan tidak langsung
(Harmita 2006).
Pada praktikum kali ini digunakan
perhitungan secara langsung jumlah mikroba pada suspensi khamir/yeast. Pada
perhitungan secara langsung dilakukan langsung dengan menggunakan sampel yang
telah disediakan pada hari itu juga. Penghitungan ini dikatakan tidak akurat jumlah mikroba
yang di dalam sampel, karena hanya berdasarkan pada mikroba yang ada. Mikroba
yang ada pada media ataupun sampel yang terhitung tidak hanya mikroba yang
hidup, mungkin saja mikroba yang mati juga terhitung. Perhitungan
ini dapat menggunakan hemositometer dan Counter atau alat-alat lain yang
sejenis. Tersedia
banyak teknik di dalam laboratorium untuk mengukur pertumbuhan mikroba .
Alat-alat yang ada tersebut berkisar dari peralatan yang masih sederhana
seperti sebuah kaca objek dengan olesan yang diwarnai. Suatu bakteri juga dapat
dihitung secara elektronik yaitu dengan cara memasukkan biakan melalui lubang
yang sangat kecil pada alat penghitung partikel counter. Alat penghitung
tersebut dapat dipakai secara rutin untuk memecah sel darah, namun dapat pula
disesuaikan untuk memecah bakteri (Volk 1993).
Untuk menghitung
jumlah sel pada suspensi khamir dibutuhkan alat yang namanya haemocytometer.
Haemocytometer
adalah suatu ruang kaca dengan sisi yang menjulang dan kaca penutup yang akan
menahan cairan tepat 0.1 mm dari atas lantai ruang kaca. Ruang hitung memiliki
total luas permukaan 9 mm2. Dasar
perhitungan menggunakan haemocytometer adalah dengan menempatkan
satu tetes suspensi bahan atau
biakan mikroba pada
alat tersebut ditutup dengan gelas penutup kemudian diamati dengan mikroskop
yang perbesarannya tergantung pada besar kecilnya mikroba. Dengan menentukan
jumlah sel rata-rata tiap petak (ruangan) yang telah diketahui volumenya, dari
alat tersebut dapat ditentukan jumlah sel mikroba.
Percobaan
dilakukan dengan membersihkan haemocytometer terlebih dahulu dengan alkohol 70% dan dilap
dengan tissue. Tujuan pembersihan
ini dilakukan agar steril sehingga pengamatan terlihat jelas oleh mata dan mempermudah
perhitungan mikroba, pembersihan dengan
mengelap dengan tissue dan usahakan tidak ada goresan pada alat ini karena akan
terlihat di
mikroskop yang dapat mengganggu pengamatan. Kemudian cover glass
diletakkan di atas Haemocytometer dengan tujuan agar mikroba yang
akan dihitung tetap bentuknya pada
ruang alat serta tidak
terkontaminasi. Kemudian suspensi khamir dipipet dan diletakkan di atas ruang hitung haemocytometer,
sebelum dipipet suspensi harus dikocok terlebih dulu agar khamir yang terdapat
dalam suspensi khamir merata dan dapat menghasilkan jumlah sel yang lebih
banyak dibanding tidak dikocok. Kemudian
mikroskop di atur dengan intensitas cahaya yang rendah atau redup sehingga
garis-garis yang terletak pada ruang haemocytometer dapat terlihat jelas. Selain cahaya, faktor perbesaran mikroskop juga
berpengaruh. Ruang haemocytometer baik di bagian bawah maupun atas akn terlihat dalam
perbesaran 4x10 dan pada percobaan terlihat jelas kamar bagian atas. Pada pebesaran tersebut, akan terlihat kotak-kotak
berukuran besar sebanyak 25 kotak. Setiap satu kotak besar berukuran 1 mm2. Satu kotak
besar yang menyusun kamar, terdapat 16 kotak kecil didalamnya sehingga kotak
kecil dalam kamar berjumlah 400 buah. Ruang yang terisi dengan mikroba
pada yang terletak pada ruang hitung dapat langsung dihitung dengan menghitung 5 kotak besar pada
posisi ujung-ujung-tengah seperti pada gambar 2 pada lampiran. Perhitungan
dibantu dengan menggunakan counter. Hasil perhitungan dirata-rata kemudian hasil rataan
dimasukkan rumus untuk kotak sedang. Perhitungan juga harus memperhatikan
faktor pengenceran, jika dilakukan pengenceran maka jumlah sel/ml dikalikan
faktor pengenceran. Jumlah yang dihasilkan pada diagonal keduanya akan sama
atau tidak jauh berbeda (Dwidjoseputro
1990).
Berdasarkan
percobaan didapat data pada tabel 1, dihasilkan jumlah mikroba dalam suspensi khamir rata-rata memiliki lebih dari 107
sel/mL. Pada kelompok 8 diperoleh jumlah mikroba yang terkandung sebesar 1,48 × 107 sel/mL
dengan perhitungan pada lampiran, dengan jumlah mikroba pada setiap kotak 36, 88, 57, 94 dan 22. Jumlah ini
cukup kecil jika dibandingkan dengan kalompok lain hal ini disebabkan pada saat
pemipetan suspensi pada ruang haemocytometer suspensi khamir tidak dikocok
terlebih dahulu sehingga dihasilkan jumlah yang kecil. Setelah didapat jumlah
mikroba yang terkandung dalam suspensi khamir, pada haemocytometer ditambahkan
metilen blue untuk dapat membedakan mikroba yang mati dan yang hidup. Dari
percobaan didapat hampir seluruh mikroba dalam suspensi khamir berwarna biru
yang artinya mikroba tersebut telah mati. Hal ini disebabkan oleh sifat membran
sel yang selektif permiable pada mikroba.
Haemocytometer memiliki kelebihan
dan kelemahan dalam proses perhitungan bakteri secara langsung. Kelebihan
perhitungan sel dengan menggunakan hemasitometer adalah dapat menghitung jumlah
sel yang hidup maupun yang mati tergantung dari pewarna yang
digunakan, seperti
pada percobaan bila pewarna metilen blue
dicampurkan kedalam larutan sel maka sel yang hidup tidak akan berwarna dan sel
yang mati akan berwarna biru. Selain itu cepat dalam menghasilkan data karena langsung
ditung pada waktu itu juga. Metode ini memiliki beberapa
kelemahan diantaranya tidak dapat
digunakan untuk mikroba yang berukuran terlalu kecil seperti bakteri.
Simpulan
Berdasarkan hasil praktikum ini diperoleh jumlah mikroba dalam
suspensi khamir dengan perhitungan mikroskopis secara langsung adalah sebesar 1,48 × 107 sel/mL.
Daftar Pustaka
Afriyanto Eddy. 2005. Pakan Ikan
dan Perkembangannya. Jakarta : Penerbit Kanisius.
Buckle K. A,dkk. 1987. IlmuPangan. H. Purnomo dan Adiono, penerjemah. Jakarta: UI-Press.
Dwidjoseputro, Prof.Dr.D. 1990. Dasar-dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta
Hadioetomo,
R.S. 1993. Mikrobiologi Dasar Dalam
Praktek : Teknik Dan Prosedur Dasar Laboratorium. Jakarta : PT Gramedia
Pustaka Utama
Harmita.
2006. Buku Ajar Analisis Hayati Edisi Ketiga. Jakarta : Penerbit Buku
Kedokteran EGC
Pelczar M.J, Chan E.C.S. 1986. Dasar-dasar
Mikrobiologi. Volume 1. Ratna Sari Hadioetomo, Teja Imas, S. Sutarmi Tjitrosomo, Sri Lestari Angka, penerjemah. Jakarta: UI-Press. Terjemahan dari: Elements
of Microbiology.
Volk. 1993. Dasar-Dasar
Mikrobiologi. Jakarta : Erlangga.
Lampiran 1 Perhitungan jumlah mikroba dalam suspensi khamir
|
36
|
|
|
|
88
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
57
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
94
|
|
|
|
22
|
Gambar 2 Ruang hitung
haemocytometer yang akan digunakan dalam
perhitungan
Contoh perhitungan jumlah mikroba dalam suspensi khamir
pada kelompok 8 :
Diketahui :
Kotak 1 = 36
Kotak 2 = 88
Kotak 3 = 57
Kotak 4 = 94
Kotak 5 = 22
Jumlah mikroba dalam suspensi khamir =
