TEKNIK ASEPTIK DAN ISOLASI BAKTERI DARI POPULASI CAMPURAN

Laporan Praktikum                             Nama               : Eka Lindawati         

Mikrobiologi                                       Kelompok        : 8

                                                            NIM               : J3L112138   

                                                            Hari, tanggal    : Jum’at, 27 September 2013

Waktu             : 14.00-17.20 WIB

                                                            PJP                 : M. Arif Mulya, S.Pi

                                                            Asisten            : Lia Suliani

                                                                                     Ramdhani

                                                                                     Yuriska Sekar Rani

TEKNIK ASEPTIK DAN ISOLASI BAKTERI DARI POPULASI CAMPURAN

                                               

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA

PROGRAM DIPLOMA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2013

Pendahuluan

Mikrobiologi adalah suatu cabang ilmu biologi yang mempelajari tentang mikroorganisme dan interaksi mereka dengan organisme lain dan lingkungannya. (Singleton 2006). Bakteri dapat dikembangkan dengan cara melakukan pertumbuhan bakteri. Pertumbuhan bakteri dapat dilakukan dengan cara ditumbuhkan pada suatu media pertumbuhan bakteri, yang biasanya berupa agar (Hardioetomo 1983). Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya (Machmud, 2008 ).

Perlakuan aseptik ialah perlakuan yang bertujuan  terbebas dari mikroorganisme. Aseptik diimbangi dengan sterilisasi yang merupakan upaya untuk menghilangkan kontamina mikroorganisme yang menempel pada alat atau bahan yang akan dipergunakan untuk analisa selanjutnya (Jati 2007). Teknik aseptik sangat diperlukan untuk menghindarkan mikroorganisme dari kontaminan yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba. Teknik aseptis digunakan sepanjang kegiatan berlangsung, baik alat, bahan, lingkungan sekitar maupun praktikannya. Untuk alat dan bahan praktikum dapat diterapkan metode sterilitas. Penguasaan teknik aseptik ini sangat diperlukan dalam keberhasilan laboratorium mikrobiologi dan hal tersebut merupakan salah satu metode permulaan yang dipelajari oleh ahli mikrobiologi  (Oram, 2001).

Tujuan

Praktikum bertujuan untuk menguasai teknik memindahkan biakan murni dari satu wadah ke wadah yang lain secara aseptik dan mempelajari cara mengisolasi bakteri dari lingkungan dengan metode penggoresan kuadran serta mengamati ciri-ciri koloni bakteri tumbuh.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan ialah tabung reaksi dan rak tabung, kawat Ose, pembakar spirtus dan cawan petri.

Bahan-bahan yang digunakan ialah media Plate Count Agar (PCA), Nutrient Broth (NB), aquades steril dan koloni mikroorganisme pada cawan petri.

Prosedur Kerja

Alkohol disemprotkan pada meja kerja dan tangan. Pembakar spirtus dinyalakan kemudian dua tabung berisi masing-masing aquades steril dan media pembiakan bakteri Nutrient Broth (NB), dipegang dengan tangan kiri membentuk huruf V yang dipisahkan dengan ibu jari. Kawat ose dipanaskan pada api dari pembakar spirtus yang berwarna biru dan dipijarkan sampai kawatnya berwarna merah dalam api. Kawat ose ditunggu hingga dingin, sambil tutup kedua tabung direnggangkan namun tetap bekerja disekitar pembakar spirtus. Tutup tabung aquades steril dibuka, bibir tabung akuades dipanaskan terlebih dahulu  dan  kawat ose dicelupkan ke dalamnya kemudian akuades steril tersebut ditutup kembali. Setelah dicelupkan, penutup tabung media NB dibuka dan bibir tabung dipanaskan terlebih dahulu dan kawat ose tadi dicelupkan ke dalam media NB. Tabung berisi media dipanaskan kembali kemudian segera ditutup dengan rapat.

Pada inokulasi bakteri dengan goresan kuadran dilakukan dengan cara data mengenai kepemilikan sampel dituliskan pada tutup cawan petri yang akan digunakan. Cawan petri dibalik dan digambarkan kuadran dengan spidol. Sampel bakteri yang ingin dipindahkan diambil dengan menggunakan oase yang sudah sebelumnya dipijarkan di atas pembakar spirtus kemudian bakteri tersebut digoreskan pada cawan petri yang sudah di gambarkan kuadran tadi. Penggoresan diulang hingga pada kuadran terakhir kemudian diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu ruang.

Data dan Hasil Pengamatan

Tabel 1 Hasil isolasi bakteri dari populasi campuran

Asal Sampel	Kelompok	Dua macam koloni yang tumbuh terbanyak
		Gambar (Sketsa)	Ciri-ciri koloni
Laboratorium CB  Mikrobiologi	1		Warna: putih kekuningan Ukuran: Sedang Bentuk: irregular Elevasi: Umbonate Permukaan: Mengkilap Margin: Undulate
W.C	2		Warna :kuning Ukuran: kecil Bentuk: bulat Elevasi :umbonate Permukaan: mengkilap Margin :undulate
Kloset	3		Warna:Putih kekuningan Ukuran: Kecil. Bentuk: Sirkular dengan tepi peripheral. Tepi: Entire tegas dan rata. Elevasi: Konveks.
Lanjutan Tabel 1 Hasil isolasi bakteri dari populasi campuran
Asal Sampel	Kelompok	Dua macam koloni yang tumbuh terbanyak
		Gambar (Sketsa)	Ciri-ciri koloni
Kantin dalam	4		Warna : Kuning muda Bentuk : Punctiform Elevasi : - Permukaan : Rata Margin : -
Kantin Pintu 4	5		Warna : Putih Ukuran : Kecil Bentuk : Elevasi Permukaan : Licin Margins : Entire1
Kolam IPAL	6		Warna:Putih Bentuk:Irregular Elevasi:Umbunate Permukaan:Undulate Margin:Undulate
Rak sepatu	7		Warna : Kuning muda Bentuk : Sirkular Elevasi : Konvex Permukaan : Rata Margin : Entire
Lorong CB	8		Warna : Putih Ukuran : besar Bentuk : Irregular Elevasi : Flat Permukaan : Licin Margins : Rata
Lanjutan Tabel 1 Hasil isolasi bakteri dari populasi campuran
Asal Sampel	Kelompok	Dua macam koloni yang tumbuh terbanyak
		Gambar (Sketsa)	Ciri-ciri koloni
Rambut	9		Warna : putih Ukuran : noktah Bentuk : Irregular Elevasi : Unbonate Permukaan : licin Margns : undulate Jumlah : 2
Nafas	10		Warna : Kuning muda Ukuran : noktah dan sedang Pigmentasi : kunig Bentuk : sirkular dengan tepi peripheral Margin : entire Elevasi : konveks

Pembahasan

Teknik aseptik dilakukan dengan penyediaan alat-alat kerja yang steril dan bekerja didekat api Bunsen agar terhindar dari kontaminan udara.pada waktu inokulasi jarum yang digunakan untuk meindahkan mikroba harus dipijarkan diatas api segera sebelum dan sesudah melakukan pemindahan. Pemanasan ini menghjancurkan semua bentuk kehidupan yang ada pada permukaan jarum atau alat pemindahan, setelah di inokulasi biakan bakteri disimpan dan diinkubasi dalam lingkungan yang sesuai untuk petumbuhan, (Dwidjoseputro 1992)

Proses penanaman kembali mikroba ke dalam media baru disebut inokulasi. Pada proses ini juga diperlukan sterilisasi yang tinggi baik untuk tempat yang akan digunakan  maupun peralatan yang akan digunakan karena jika tidak hasil pengamatan dapat terkontaminasi dan hasilnya menjadi tidak sesuai dengan harapan. Sterilisasi merupakan salah satu teknik aseptik yang bertujuan untuk menghilangkan kontaminan yang dapat mengganggu mikroba yang akan dibiakkan kembali. Steriliasasi yang dilakukan berupa membersihkan area sekitar yang akan digunaakan sebagai tempat bekerja untuk melakukan percobaan dan tangan dengan alkohol 75% sehingga dapat dihasilkan hasil percobaan yang akurat. Pada percobaan kali ini teknik aseptik yang dilakukan adalah dengan pemijaran dengan menggunakan pembakar spirtus. Teknik pemijaran dilakukan dengan cara membakar alat jarum inokulasi atau kawat ose secara langsung pada api yang dihasilkan oleh spirtus. Pemijaran tersebut bertujuan untuk membunuh mikroorganisme yang dapat mengganggu hasil percobaan sehingga mikroba yang diinginkan akan tumbuh tanpa adanya kontaminan.

Percobaan pertama dilakukan dengan memeriksa bakteri pada akuades steril yang di dalamnya tidak terdapat mikroba dengan memindahkannya menggunakan oase yang telah dipijarkan ke dalam media NB dengan teknik yang aseptik. Jarum ose dipanaskan hingga membara berfungsi untuk mensterilsasi jarum sebelum digunakan dari mikroorganisme lain, kemudian bibir tabung dipanaskan berfungsi untuk mensterilisasi tabung dan biakan dari mikroorganisme lain. Pengambilan bakteri dari tabung akuades dengan oase ke media NB, memungkinkan bakteri dapat terambil banyak. Mulut tabung akuades yang akan dianalisa  dipanaskan kembali, berfungsi untuk mensterilisasi tabung dan biakan dari mokroorganisme lain. Kemudian segera di tutup bertujuan agar keadaan mikroorganisme di dalam tabung reaksi tetap steril, apabila ada kontaminan yang akan masuk sehingga tidak akan mempengaruhi mikroorganisme yang akan di biakan.

Setiap perlakuan dilakukan secara aseptis di dekat api pembakar spirtus. Hal ini berfungsi agar saat inokulasi, bahan serta alat gelas yang digunakan tetap steril. Teknik pemegangan tabung media NB dan tabung aquades steril berbentuk pola V dan dipisahkan dengan ibu jari. Hal ini digunakan untuk mempermudah dalam pemindahan mikroorganisme dari media satu ke media yang baru. Selain itu media yang akan dipergunakan jangan terlalu dibuka terlalu lebar agar kemungkinan terkontaminasinya cukup rendah sehingga perolehan hasil lebih akurat.

Secara hipotesa, tidak akan ada bakteri yang tumbuh di dalam media NB karena sampel yang digunakan adalah akuades steril yang kemungkinan besar sudah disterilisasi sehingga tidak terdapat lagi bakteri. Setelah dilakukan inkubasi selama 2x24 jam, seharusnya media NB yang awalnya bening harusnya tetap bening. Namun pada percobaan hasilnya berbeda dengan hipotesa sebelumnya. Media NB yang digunakan sebelumnya sudah terdapat suspensi-suspensi kecil di dalam tabungnya sehingga ketika dimasukkan oase dari tabung akuades dan setelah diinkubasi warna larutannya berubah agak sedikit keruh dari warna larutan awalnya dapat dilihat pada gambar 1. Sehingga dapat dikatakann bahwa hasil negatif pada percobaan aseptik ini selain dipengaruhi oleh larutan NB itu sendiri dipengaruhi juga oleh beberapa faktor diantaranya setelah jarum inokulasi dipijarkan atau disterilkan, langsung dicelupkan ke dalam akuades steril dalam keadaan panas. Seharusnya kawat ose harus ditunggu sampai suhunya tetap setelah pemijaran atau setelah dingin baru kemudian dimasukkan ke dalam akuades dan segera dipindah ke media NB. Kesalahan dapat timbul juga karena terlalu lama berinteraksi dengan udara dan kawat ose yang telah dicelupkan pada aquades steril tidak secepatnya dimasukkan ke dalam media agar, sehingga banyak mikroorganisme dari udara yang masuk.

Gambar 1 Hasil teknik aseptik pada medium NB

Dalam bidang ilmu mikrobiologi untuk dapat menelaah bakteri khususnya dalam skala laboratorium maka terlebih dahulu kita harus menumbuhkan mereka dalam suatu biakan yang mana didalamnya hanya terdapat bakteri yang kita butuhkan tersebut tanpa adanya kontaminasi dari mikroba lain. Biakan yang semacam ini biasanya dikenal dengan istilah biakan murni. Untuk melakukan hal ini, haruslah dimengerti jenis-jenis nutrien yang dibutuhkan bakteri dan juga macam lingkungan fisik yang menyediakan kondisi optimum bagi pertumbuhan bakteri tersebut (Pelczar 1986).

Percobaan kedua adalah pemindahan bakteri (inokulasi) dari populasi campuran sehingga didapat bakteri tunggal/ biakan murni. Metode isolasi bakteri dapat dilakukan dengan beberapa cara. Salah satunya yang digunakan dalam percobaan adalah metode cawan gores. Metode ini mempunyai dua keuntungan yaitu menghemat waktu dan bahan namun terdapat pula kelemahannya yaitu bakteri anaerob tidak dapat tumbuh. Namun untuk hasil yang baik diperlukan keterampilan yang diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores yang dilakukan dengan baik akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan. Dapat diambil hipotesa awal yaitu seharusnya didapatkan mikroorganisme yang telah terpisah dari koloninya dan hanya berjumlah sedikit saja.

Berdasarkan percobaan diperoleh data seperti pada tabel 1. Gambar 10 merupakan pembiakan murni yang mikroorganismenya tumbuh dengan sempurna. Apabila terdapat mikroorganisme yang terdapat di luar jalur zigzag, mikroorganisme tersebut bukanlah mikroorganisme yang berasal dari pembiakan murni, melainkan kontaminan yang juga hidup bersama dengan biakan mikroorganisme di dalam media.

Namun setelah percobaan dilakukan, bakteri yang digoreskan pada jalur zigzag semuanya tumbuh subur sehingga tidak ada yang terpisahkan. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh beberapa faktor diantaranya bakteri yang dipindahkan sudah terkontaminasi oleh jamur sehingga media baru tersebut terpenuhi bakteri subur yang tak dapat dipisahkan, teknik penggoresan yang buruk sehingga media tersobek. Faktor lain yang dapat menyebabkan gagalnya mikroorganisme terpisahkan ialah setelah kawat ose dipijarkan dengan api spirtus dalam teknik sterilisasi, langsung ditempelkan ke media yang penuh dengan koloni bakteri. Seharusnya setelah kawat ose dipijarkan, ditunggu hingga kawat ose dingin, kemudian mengambil mikroorganisme yang terpisah dari koloni. Kawat ose dalam keadaan panas, dapat menyebabkan mikroorganisme mati, sehingga tak ada mikroorganisme yang tumbuh pada media agar yang baru atau mungkin hanya jamur yang tumbuh sedangkan bakteri yang akan dipindahkan mati.

Simpulan

Berdasarkan percobaan dapat disimpulkan bahwa pemindahan mikrob secara aseptik telah gagal dilakukan karena berbagai faktor dan isolasi bakteri dari populasi campuran gagal dilakukan juga karena mikroorganisme dalamnya tumbuh subur.

Daftar Pustaka

Dwidjoseputro. 1992. Mikrobiologi Pangan. Jakarta : Gramedia Pustaka Utama

Hardioetomo R. S. 1983. Mikrobiologi dalam Praktek. Bogor: IPB Press.

Jati Wijaya. 2007. Biologi Interaktif. Jakarta : Ganeca Exact.

Machmud, M. 2008. Teknik Penyimpanan dan Pemeliharaan Mikroba. Balai Penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan, Bogor.

Oram, R.F. S., Paul. J. Hummer, Jr. 2001. Biology Living System. Glencoe Division Mc Millan Company. Waterville.

Pelczar, Michael. 2006.Dasar-Dasar Mikrobiologi. Ratna Sri, penerjemah. Jakarta: Universitas Indonesia Press.terjemahan dari : Elements of Microbiology.

Singleton Paul.2006. Dictionary of Microbiology And Molecular Biology Third Edition. England : John wiley & Sons Inc.